一、提取外周血淋巴細(xì)胞時(shí)注意事項(xiàng)

如果取外周血淋巴細(xì)胞 （PBMC） 進(jìn)行ELISPOT檢測，采用新鮮血液。在保證無菌操作的前提下，首先應(yīng)保證取血時(shí)抗凝劑應(yīng)及時(shí)充分的與血液混勻，避免血凝塊的出現(xiàn)?？鼓皶r(shí)提取PBMC，避免放置時(shí)間過長，室溫下避免過夜。應(yīng)選用分離效果好的淋巴細(xì)胞分離液，避免PBMC中混有過多其他細(xì)胞成分或雜質(zhì)。

外周血出現(xiàn)溶血后，在使用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC時(shí)，溶血產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、血紅素等雜質(zhì)將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取PBMC時(shí)非常容易混入這些雜質(zhì)，由于混入細(xì)胞的細(xì)胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)時(shí)，有可能沉積在培養(yǎng)板底，嚴(yán)重影響細(xì)胞因子和抗體的結(jié)合，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

使用淋巴細(xì)胞分離液，推薦使用進(jìn)口淋巴細(xì)胞分離液，如：Lymphoprep，或者NycoPrep 1.077（無寡糖）。避免使用紅細(xì)胞裂解液分離淋巴細(xì)胞。

二、從動物脾臟組織分離淋巴細(xì)胞

取動物脾臟組織時(shí)，應(yīng)注意取材的無菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過200目篩網(wǎng)，保證所分離的細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞懸液。獲得細(xì)胞懸液后應(yīng)該使用相應(yīng)的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)一步分離單個(gè)核細(xì)胞。

三、在ELISPOT板上，每孔我應(yīng)該放置淋巴細(xì)胞的數(shù)目

在使用ConA，PHA等陽性刺激孔中，一般放置的淋巴細(xì)胞數(shù)為 10^4～2×10⁵。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細(xì)胞濃度可在1～4×105。在使用多克隆刺激劑的情況下，應(yīng)適當(dāng)調(diào)低細(xì)胞濃度。但由于所用刺激劑的強(qiáng)度和批號不同，建議初次進(jìn)行ELISPOT檢測時(shí)，對刺激劑濃度和細(xì)胞濃度設(shè)立梯度，以保證較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

四、對淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外刺激預(yù)孵育、或板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)

1、將抗原和淋巴細(xì)胞在體外混合，刺激并預(yù)孵育，是通用的方法。預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞，在置入ELISPOT板之前應(yīng)使用復(fù)溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細(xì)胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5～6小時(shí)。

2、對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細(xì)胞和抗原同時(shí)加入ELISPOT板孔中，37℃培養(yǎng)箱中，同步進(jìn)行刺激、培養(yǎng)、和細(xì)胞因子捕獲。淋巴細(xì)胞板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)的時(shí)間通常為22～24小時(shí)。

3、ELISPOT試驗(yàn)檢測的是每一個(gè)分泌細(xì)胞因子的活化細(xì)胞。在培養(yǎng)細(xì)胞過程中，任何移動、震動（包括開關(guān)培養(yǎng)箱門）都會導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)板上的移動，從而得到不規(guī)則斑點(diǎn)或者斑點(diǎn)花紋，影響zui終結(jié)果。因此細(xì)胞在ELISPOT培養(yǎng)板孵育的過程中，應(yīng)注意保持培養(yǎng)板的靜置，不應(yīng)對其移動。

4、在使用抗原刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，這種現(xiàn)象通常見于使用很強(qiáng)的多克隆抗原刺激淋巴細(xì)胞，某些多克隆抗原會導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡或者死亡，大量淋巴細(xì)胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)ELISPOT試驗(yàn)通常得到很低的斑點(diǎn)（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現(xiàn)象。

5、在ELISPOT結(jié)果中出現(xiàn)不規(guī)則的大塊斑點(diǎn)，有的區(qū)域沒有斑點(diǎn)的原因，不規(guī)則斑點(diǎn)區(qū)域的出現(xiàn)一般是細(xì)胞分離不*所至，有時(shí)候采用多克隆抗原孵育的淋巴細(xì)胞也會產(chǎn)團(tuán)現(xiàn)象。請確認(rèn)加入到ELISPOT板中進(jìn)行孵育的是單細(xì)胞懸液。

6、使用開口較大的吸頭，動作輕柔，避免對細(xì)胞的吹打，減少剪切力對淋巴細(xì)胞的傷害。