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    一、膠和膜放反了：如果在轉印的過程中，膠和膜的位置顛倒了，那么蛋白就從膠上轉移到緩沖液中，而不會到達膜上。對于標準的轉印，凝膠應靠近三明治的負極，而膜對應正極。

    二、轉膜效率低：轉膜效率受多種因素影響，包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場強度、轉印時間和緩沖液的PH值。一般來說，蛋白越大，轉移的越慢。轉移大蛋白的方法是用高的電場強度。而小蛋白長時間處于高電場強度下可能會傳出轉印膜。避免這個問題的方法是用0.2μm孔徑的PVDF膜進行轉印。如果蛋白的等電點接近緩沖液的pH值，那么這個蛋白攜帶的電荷很少，在電場中頁幾乎不移動。如果你的目的蛋白是強堿性的，那么你可以用碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩沖液。

    三、試劑放置太久或存放條件不正確：抗體會慢慢降解，如果反復凍融的話，它會快速降解。底物應儲存在-20℃。

    四、抗體不純或滴度太低：一抗的濃度差異很大，應該根據經驗來決定一抗的稀釋度。一般的原則是以1：100-1:1000來稀釋血清或組織培養(yǎng)上清，以1：1000-1：10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1：3000。

    五、酶失活了：疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要再HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結合的抗體中，而*。另外，只能使用蒸餾的去離子水。

    六、使用Tween-20洗滌：Tween-20(吐溫-20)可能會干擾某些抗體-抗體相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。因此除了封閉之后的次洗滌，其他洗滌過程中都不使用Tween-20。

    七、檢測系統(tǒng)缺乏足夠的靈敏度：確保蛋白的上樣量在檢測系統(tǒng)的靈敏度范圍內。

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