細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對(duì)于整個(gè)生物工程技術(shù)，還是其中之一的生物克隆技術(shù)來(lái)說(shuō)，細(xì)胞培養(yǎng)都是一個(gè)*的過(guò)程，細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的大規(guī)模克隆。細(xì)胞培養(yǎng)，既包括微生物細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)大量培養(yǎng)成為簡(jiǎn)單的單細(xì)胞或極少分化的多細(xì)胞，這是克隆技術(shù)*的環(huán)節(jié)，而且細(xì)胞培養(yǎng)本身就是細(xì)胞的克隆。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。因?yàn)樯锂a(chǎn)品都是從細(xì)胞得來(lái)，所以可以說(shuō)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生物技術(shù)中zui核心、zui基礎(chǔ)的技術(shù)。

細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

一、清洗

新采用和重新使用的培養(yǎng)器皿，都要嚴(yán)格清洗，以防各種有害物質(zhì)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞損害。培養(yǎng)用的塑料器皿目前主要依靠進(jìn)口，均已無(wú)菌密封包裝，可直接使用。對(duì)于塑料瓶蓋或膠塞等，可水中浸泡后用2％NaOH煮沸10～20min，自來(lái)水中浸泡和蒸餾水漂洗2～3次，晾干備用。細(xì)胞培養(yǎng)中的絕大部分器皿系玻璃制品，清洗過(guò)程為以下步驟。

1. 浸泡　新使用或重復(fù)使用的玻璃器皿須經(jīng)5％鹽酸溶液或自來(lái)水浸泡過(guò)夜或煮沸30min，水洗。以去除新購(gòu)進(jìn)玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質(zhì)，并消除其弱堿性。

2． 刷洗　浸泡后用軟毛刷和的洗潔精進(jìn)行刷洗。

3． 酸浸　刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當(dāng)晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋?zhuān)绊懶Ч?。將玻璃制?浸泡入清潔液中24h。清潔液具有*酸蝕作用，操作過(guò)程需戴防護(hù)用具。

4． 沖洗　浸酸后的玻璃器皿先用自來(lái)水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿(mǎn)自來(lái)水、倒掉反復(fù)10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗2～3次，烘干備用。要求干凈透明，無(wú)油煙，不能殘留任何有害物質(zhì)及化學(xué)藥品等。

二、消毒

1. 包裝　器材經(jīng)清洗烤干或晾干后，先應(yīng)嚴(yán)格包裝，然后再行消毒滅菌處理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。

2. 消毒　消毒滅菌隨物品的不同，而采用不同的方法。

（1）紫外線：主要用于消毒實(shí)驗(yàn)室空氣、工作臺(tái)面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進(jìn)無(wú)菌室前或做完實(shí)驗(yàn)后，均應(yīng)開(kāi)燈照射30min進(jìn)行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細(xì)菌。

（2）消毒劑：操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用碘酒、酒精消毒。無(wú)菌室內(nèi)桌椅和物體的消毒可用0.1％新潔爾滅、過(guò)氧乙酸、來(lái)蘇兒等擦拭或浸泡。實(shí)驗(yàn)室、無(wú)菌室的消毒可用甲醛熏蒸（高錳酸鉀5～7.5g，加40%甲醛10～15ml，混合放入一開(kāi)放容器內(nèi)，立即可見(jiàn)白色甲醛煙霧，房間密閉24h即可）。

（3）干熱消毒：多用于玻璃器皿消毒，干熱烤箱180℃45～60min。

（4）濕熱消毒：培養(yǎng)液、橡膠制品、塑料器皿等用68kPa（115℃）高壓滅菌10min；布類(lèi)、玻璃制品、金屬器械等用103kPa（121.3℃）高壓滅菌15～20min。

（5）濾過(guò)消毒：用孔徑200～450nm大小的濾板可除去培養(yǎng)液和試劑中的細(xì)菌和霉菌等。用200nm孔徑的濾板通過(guò)兩次，可使支原體達(dá)到某種程度的去除，但不能除去病毒。濾器分為負(fù)壓和加壓式兩種。過(guò)濾的液體量很少時(shí)，可選用注射器微量濾膜濾器。

（6）60Co照射：不耐熱的塑料制品或一次性用品的滅菌可經(jīng)包裝后，用γ射線照射消毒。

三、無(wú)菌操作

無(wú)菌操作是防止污染、決定培養(yǎng)是否成功的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，在一切操作中要努力做到zui大限度的無(wú)菌。工作前對(duì)手部需清洗消毒，進(jìn)無(wú)菌操作室時(shí)戴口罩和穿工作服。不能用手直接觸及已消毒器皿內(nèi)部。打開(kāi)培養(yǎng)瓶前或封閉瓶口前須火焰燒灼瓶口等。

四、取材

取材應(yīng)注意無(wú)菌操作，防止污染。污染組織應(yīng)放入含兩性霉素B（2μg/ml）、青霉素（500u/ml）、鏈霉素（500μg/ml）的培養(yǎng)液中浸泡10～20min。取材后應(yīng)立即進(jìn)行培養(yǎng)。如因故不能培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)在無(wú)菌條件下，把組織塊切成1cm3大小置于培養(yǎng)液中37℃貯存。存放時(shí)間不宜超過(guò)24h。

1． 源自人體的腫瘤和其他病理組織的取材、貯存和運(yùn)送須注意防止污染。

2． 取血：多采用靜脈血，注意無(wú)菌操作，如需應(yīng)用肝素等抗凝劑，也要注意消毒處理。血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液，可采用離心法分離，500～1000r／min，離心5～10min即可。

3． 動(dòng)物組織：動(dòng)物皮毛易隱藏微生物，且不易消毒，應(yīng)特別注意無(wú)菌操作。

五、細(xì)胞分散法

1． 機(jī)械分散　對(duì)于腦、胚胎、腫瘤等軟組織，先用組織勻漿器研磨組織，再通過(guò)細(xì)胞篩獲得單細(xì)胞懸液。

2． 胰蛋白酶消化　適合于消化間質(zhì)較少的軟組織，傳代細(xì)胞消化也常采用，是應(yīng)用較廣泛的消化酶，由于Ca2+ 和Mg2+ 對(duì)胰蛋白酶活性有一定抑制作用，因此須用不含這些離子的緩沖液配制。將組織剪成1mm3大小，置于容器中，加入30～50倍體積的0.25%胰蛋白酶液，消化30～60min。

3． 膠原酶消化　對(duì)膠原有較強(qiáng)的消化作用，適用消化纖維組織、上皮組織及瘤組織等。膠原酶的使用終濃度為200U/ml或0.1～0.3μg/ml，其消化作用緩和。一般將3～5倍膠原酶溶液加入已剪碎的組織塊中，數(shù)小時(shí)或10余小時(shí)后，可見(jiàn)組織塊逐步變小至幾乎看不見(jiàn)，原來(lái)澄清的消化液轉(zhuǎn)變成混懸液時(shí)，可以終止消化，如組織塊較大、細(xì)胞量較多時(shí)，可于消化期間換消化液一次。消化液經(jīng)低速離心5min后，去上清液，加入20％小牛血清培養(yǎng)液，輕輕打散細(xì)胞團(tuán)，制成細(xì)胞懸液。

4． EDTA溶液分散　使用濃度為0.02%的EDTA溶液。常用于傳代細(xì)胞的消化，作用溫和，毒性小。

六、淋巴細(xì)胞分離法

取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀釋后，沿試管壁慢慢加入4ml淋巴細(xì)胞分離液之表面，勿與分離液混合。然后2000r/min水平離心20min，管內(nèi)分4層，自上而下依次為血漿、單個(gè)核細(xì)胞（位于細(xì)胞分離液上界與血漿下界的中間呈白色霧狀層）、顆粒白細(xì)胞（位于淋巴細(xì)胞分離液下界與底層紅細(xì)胞上界的交界處）和紅細(xì)胞（位于管底）。用毛細(xì)吸管沿管壁輕輕吸出的淋巴細(xì)胞層。然后用Hanks液洗兩次，每次2000r/min離心10min，zui后計(jì)數(shù)供用。

七、細(xì)胞計(jì)數(shù)

待測(cè)細(xì)胞懸液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%臺(tái)盼藍(lán)0.1ml（死細(xì)胞著色）,混合后滴入血球計(jì)數(shù)板內(nèi)。于低倍鏡下計(jì)數(shù)4角的4個(gè)大方格內(nèi)的活細(xì)胞（透明未著色）總數(shù),然后用下式計(jì)數(shù):

細(xì)胞數(shù)/每毫升原液=（4大方格內(nèi)活細(xì)胞數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)

細(xì)胞存活率=（活細(xì)胞數(shù)/活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100％

在計(jì)數(shù)時(shí)遇到對(duì)大方格壓線的細(xì)胞，應(yīng)按數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)。

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