上海勁馬生物溫馨提示：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過1個月，-80℃不應(yīng)超過2個月；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。對于每一項IHC/ICC研究，組織和細胞樣本的制備都不可掉以輕心。為了方便孵育，整個組織必須被切成超?。?-10 μm）的切片，或切成小塊用于整體免疫組化（whole mount IHC）。對于ICC實驗，在開始染色步驟之前，細胞必須附著在顯微鏡載玻片或蓋玻片上。樣本制備也與固定方法密切相關(guān)，而固定方法又會受到檢測技術(shù)（熒光 vs 顯色）的影響。
在大部分情況下，某個實驗變量將決定樣本制備的zui合適方法。例如，浸潤固定在甲醛中的組織必須石蠟包埋，并利用切片機切片?；蛘?，為了檢測磷酸化依賴的表位，組織可能需要快速冷凍，因此在醇類固定之后就需要一個低溫箱來進行樣本切片。
石蠟包埋的組織
石蠟包埋為長期保存組織樣本提供了*選擇。組織在用石蠟包埋之前必須固定。固定可通過灌注或解剖后立即浸潤來實現(xiàn)，一般需要4-24小時。不建議固定組織24小時以上，因為固定過度可能導(dǎo)致抗原的遮蔽。如有必要，組織在固定后可轉(zhuǎn)移至酒精中，直至包埋過程。
因為石蠟與水是不混溶的，所以組織在加入熔化的固體石蠟前必須脫水。脫水是通過浸潤在濃度遞增的酒精中而實現(xiàn)的。這種方法逐步改變疏水性，讓細胞傷害zui小化。脫水之后，組織與二甲苯共同孵育，以去除任何殘留的酒精。石蠟一般加熱到60?C進行包埋，隨后過夜硬化。之后利用切片機用鋒利的刀片將組織切成超薄的切片。切片在顯微鏡載玻片上干燥，并長時間室溫儲存。組織切片在開始IHC/ICC步驟之前必須再水化。石蠟是組織包埋的*也是zui常用的物質(zhì)。不過，組織也可包埋在塑料中，凝固得更硬，并切成更薄的組織切片（1.5μm vs 5 μm）。 
冰凍組織
冰凍組織樣本的好處之一是省去了石蠟包埋組織zui初所需的固定步驟。在檢測翻譯后修飾如磷酸化時，快速冷凍特別有益。冰凍組織的制備可將組織浸潤在液氮或異戊烷中，或埋在干冰里。對于冰凍組織，在冷凍和切片之后進行一個短時間的固定。冰凍組織切片zui常用醇類固定，這避免了修復(fù)甲醛交聯(lián)所遮蔽的表位的需要。冰凍組織在低溫箱中切片，切片在-80?C可儲存多達1年。
冰凍組織切片的處理時間比石蠟包埋切片要短一些。不過，冷凍對于組織的長期保存是不夠的，且細胞內(nèi)冰晶的形成可能會負面影響亞細胞的細節(jié)。此外，冰凍切片通常比石蠟切片厚。這可能導(dǎo)致較低的顯微鏡分辨率以及差的組織形態(tài)學(xué)圖像。因為冰凍切片通常保留酶的活性，所以封閉可能影響IHC檢測的內(nèi)源酶的活性也是特別重要的。
IHC樣本制備的比較
 組織
 石蠟包埋冰凍
固定包埋前切片后
切片切片機低溫箱 
儲存在室溫下多年在-80?C一年
優(yōu)勢保留組織形態(tài)保留酶和抗原的功能 
劣勢固定過度可能遮蔽表位冰晶的形成可能負面影響組織結(jié)構(gòu)
細胞樣本
在開展ICC研究時，首先必須將細胞附著在固體支持物上，如顯微鏡載玻片或蓋玻片。這對于貼壁細胞很簡單，它們可直接放置在6孔或24孔板底部的無菌蓋玻片上生長。將蓋玻片預(yù)包被一層帶電荷的聚合物（如多聚賴氨酸）和/或細胞外基質(zhì)蛋白（如層粘連蛋白、纖維粘連蛋白或膠原），可增強細胞附著。染色過程的所有步驟可在微孔板內(nèi)的蓋玻片上開展，向每個孔中加入適當(dāng)?shù)娜芤翰⒁谱呷芤?。懸浮細胞可通過Cytospin® 離心或與包被多聚賴氨酸的玻片孵育10分鐘而附著在玻片上