酶聯(lián)免疫法，簡稱ELISA。
 

　　它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然后通過顯色來檢測。
 

　　步驟：ELISA用血清來檢測，首先血液要經(jīng)過至少半個小時的凝集，然后取血清（這是有些網(wǎng)友不理解為什么醫(yī)院抽完了血對血置之不理的原因，其實是誤會）。將酶復合物用稀釋液稀釋后，加血清及陰性、陽性對照，還有就是質(zhì)控品（這是嚴格的要求，它的范圍必須在質(zhì)控范圍內(nèi)）。經(jīng)過一個小時的孵育，然后洗板，加底物，半個小時避光反應后加終止液即完成反應部分，然后就是讀數(shù)。由數(shù)值來判斷結果的陰性或陽性。
 

　　基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質(zhì)分開，zui后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
 

　　ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。
 

　　具體方法有：
 

　　（一）雙抗體夾心法
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
 

　?。?）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質(zhì)。
 

　　（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質(zhì)。
 

　?。?）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關。
 

　?。?）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
 

　　根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
 

　　在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。
 

　　在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
 

　　假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
 

　　雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現(xiàn)出假陽性反應。采用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由于去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
 

　　雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
 

　　（二）雙抗原夾心法測抗體
　反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。
 

　　（三）雙位點一步法
在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
 

　　在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結果。
 

　　（四）間接法測抗體
間接法是檢測抗體zui常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
 

　　（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質(zhì)。
 

　　（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
 

　?。?）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
 

　?。?）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
 

　　本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
 

　　間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應?？乖幸膊荒芎信c酶標抗人Ig反應的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。
 

　　間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。
 

　　（五）競爭法
競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
 

　　（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
 

　　（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結合可達zui充分的量。洗滌。
 

　　（3）加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原zui多，故顏色zui深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養(yǎng)體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關系來zui終確定體系的zui終檢測目標的濃度。
 

　　當抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般采用此法。
 

　　（六）捕獲法測IgM抗體
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：
 

　　（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
 

　?。?）加入稀釋的血清標本：保溫反應后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
 

　　（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
 

　　（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
 

　　（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。
 

　　（七）應用親和素和生物素的ELISA
親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學方法制成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經(jīng)結合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯(lián)起來，就可大提高ELISA的敏感度。
 

　　親和素－生物素系統(tǒng)在ELISA中的應用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應放大?？梢栽诠滔嗌舷阮A包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。

ELISA的試劑　　在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分： >>詳細
 

　?。?）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
 

　　（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；
 

　?。?）酶的底物；
 

　　（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；
 

　?。?）酶聯(lián)物（結合物）及標本的稀釋液；
 

　?。?）洗滌液；
 

　?。?）酶反應終止液。
 

　　具體產(chǎn)品有：

　　上海勁馬實驗設備有限公司的“ELISA試劑盒”。