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DNA重組技術(shù)的操作步驟

更新時(shí)間:2024-04-18 瀏覽次數(shù):838

DNA重組包括五個(gè)步驟:

 

(1)目的基因的獲取


獲取目的基因的方法主要有三種:


1.反向轉(zhuǎn)錄法:利用mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得目的基因的方法。

 

2.從細(xì)胞基因組直接分離法:常用"鳥(niǎo)-槍法",這種方法猶如用散彈打鳥(niǎo),所以又稱"散彈槍法"。"鳥(niǎo)-槍法"分離目的基因,具有簡(jiǎn)單、方便和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),許多病毒和原核生物、一些真核生物的基因,都用這種方法獲得了成功的分離。

 

3.人工合成法:化學(xué)合成目的基因是20世紀(jì)70年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù),應(yīng)用化學(xué)合成法,可在短時(shí)間內(nèi)合成目的基因??茖W(xué)家們已相繼合成了人的生長(zhǎng)激素釋放抑制素、胰島素、干擾素等蛋白質(zhì)的編碼基因。

 

(2)DNA分子的體外重組

 

體外重組是把載體與目的基因進(jìn)行連接。例如以質(zhì)粒作為載體,首先要選擇合適的限制性內(nèi)切酶,對(duì)目的基因和載體進(jìn)行切割,再以DNA連接酶使切口兩端的脫氧核苷酸連接,于是目的基因被鑲嵌進(jìn)質(zhì)粒DNA,重組形成了一個(gè)新的環(huán)狀DNA分子(雜-種DNA分子)。

 

(3)DNA重組體的導(dǎo)入

 

把目的基因裝在載體后,把它引入受體細(xì)胞中;導(dǎo)入的方式主要包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、微粒轟擊和電擊穿孔等方式,轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細(xì)菌一類的原核生物細(xì)胞和酵母這樣的低等真核生物細(xì)胞,其他方式主要應(yīng)用于高等動(dòng)植物的細(xì)胞。

 

(4)受體細(xì)胞的篩選

 

由于DNA重組體的轉(zhuǎn)化成功率不高,需要在眾多的細(xì)胞中把成功轉(zhuǎn)入DNA重組體的細(xì)胞挑出,應(yīng)先找到特定的標(biāo)志,證明是否導(dǎo)入成功。

 

(5)基因表達(dá)

 

目的基因在成功導(dǎo)入受體細(xì)胞后,其所攜帶的遺傳信息必須通過(guò)合成新的蛋白質(zhì)才能表現(xiàn)出來(lái),從而改變受體細(xì)胞的遺傳性狀。目的基因在受體細(xì)胞中要表達(dá),需要滿足一些條件。例如,目的基因是利用受體細(xì)胞的核糖體來(lái)合成蛋白質(zhì),因此目的基因必須含有能啟動(dòng)受體細(xì)胞核糖體工作的功能片段。

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